Linking pollution-induced community tolerance (PICT) and community shifts induced by chronic exposure to metal contamination for microbial and nematode communities

Hoofdaanvrager:

Dr. M. Rutgers, Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu, Laboratorium der Ecotoxicologie

Resultaat van het programma

Het doel van het programma was het aantonen van veldeffecten van diffuse metaal­verontreiniging op bodemecosystemen in het gebied van de Ronde Venen. Drie projecten bij drie onderzoeksinstellingen (Vrije Universiteit Amsterdam, Wageningen Universiteit en Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu) maakten onderdeel uit van het programma waarin 2 AIO’s (1,5 fte over 4 jaar; Boivin en Kools), 1 postdoc (1 fte over 3 jaar; Van der Wurff), en een analist (0,33 fte over 3 jaar; Greve) figureerden. Beide AIO’s zijn gepromoveerd, en het programma is afgerond. AIO’s, postdoc en de analist hebben nieuw werk gevonden.

Het doel is bereikt, namelijk het onderzoek heeft aannemelijk gemaakt dat in het zogenaamde Toemaakdek in de Ronde Venen de zware metalen effecten hebben op het bodemecosysteem. In de drie projecten van het programma werden verschillende aanwijzingen hiervoor gevonden, op het niveau van de microbiële gemeenschap, de nematodengemeenschap, functionele bodemparameters, en de potwormen. De verschillende aanwijzingen zijn in diverse artikelen gepubliceerd.

Resultaat van de projecten

Onderzoeker:

Ing. G. Greve Loopduur: 01-03-2002 tot 30-04-2005
Dr. S.A.E. Kools Loopduur: 01-01-2001 tot 01-01-2005
Dr. A.W.G. van der Wurff Loopduur: 01-09-2001 tot 01-09-2004

014.23.061 Ing. G. Greve

Diversiteit van microbiële gemeenschappen bij heterogene metaalveront­reinigde milieus

 Wanneer de overheidsnormen voor metaalvervuiling in de bodem worden overschreden, treden veranderingen op in de microbiële gemeenschap in die bodem. Dat hebben Marie-Elène Boivin en Gerdit Greve aangetoond in hun studie naar de invloed van zware metalen op bacteriële gemeenschappen. Die veranderingen kunnen het bodem­ecosysteem aantasten. Bacteriën zijn overal en onmisbaar voor een gezond ecosysteem, ze spelen een sleutelrol in bijvoorbeeld de omzetting van organisch materiaal, zodat voedingsstoffen weer bruikbaar worden voor andere organismen. Hun diversiteit is indrukwekkend. Een gram grond telt ongeveer 10⁴-10⁵ verschillende soorten bacteriën. Een hectare akkergrond bevat 3000 kg bacteriën in de bovenste 25 cm, dat is gelijk aan de biomassa van ongeveer vier koeien of zestig schapen. Door de extreme diversiteit is de studie van bacteriële gemeenschappen niet eenvoudig en is de combinatie van technieken de meeste geschikte aanpak om bacteriële gemeenschappen te analyseren. Boivin en Greve pasten in hun onderzoek fysiologische en genetische methoden toe. De onderzoekers bestudeerden bacteriële gemeenschappen van akkergrond van Vinkeveen en van sediment van de Afferdensche en Deestsche waarden en van de Sliedrechtse Biesbosch. Deze drie locaties zijn vervuild met zware metalen, en dat kan een negatieve invloed op het ecosysteem hebben. Boivin en Greve vergeleken de effecten op bacteriegemeenschappen daar met de classificatie van grond en sedimenten gebaseerd op de Nederlandse Streef- en Interventiewaarden. Metaaleffecten bij de bacteriegemeenschappen kwamen alleen voor op die plaatsen waar de Interventiewaarden voor lood en koper werden overschreden.

Management samenvatting

Effecten van metalen in bodemecosystemen van graslanden in de Gemeente De Ronde Venen werden aangetoond op het niveau van de interventiewaarde voor lood en koper. Effecten van metalen op bacteriegemeenschappen in biofilms van sedimenten in de Afferdensche en Deestsche waarden en de Sliedrechtse Biesbosch konden niet worden aangetoond, waarschijnlijk als gevolg van een te sterke dynamiek in deze systemen en een relatief lage belasting. Voor het onderzoek werden drie verschillende technieken ingezet om subtiele veranderingen in de samenstelling van bacteriegemeenschappen aan te tonen, namelijk op het niveau van de fysiologische en genetische eigenschappen, en op het niveau van de gevoeligheid van de gemeenschap voor het verontreinigende metaal. Optimalisatie en validatie van de methoden voor bemonstering, extractie en opslag van bacteriën in het laboratorium, en voor de verschillende analyses vormde een integraal onderdeel van het onderzoek. Geconcludeerd werd dat deze methoden zeer gevoelig en ecologisch relevant zijn, en uitermate geschikt voor ‘higher tier testing’ in een locatie-specifieke ecologische risicobeoordeling.

Uitgebreide samenvatting van het onderzoek

Het effect van metalen op de diversiteit van microbiële gemeenschappen op de drie metaal­verontreinigde onderzoekslocaties van SSEO werd onderzocht. Micro-organismen zijn onmisbaar voor een gezond (bodem)ecosysteem. Ze spelen een sleutelrol in belangrijke processen zoals de omzetting van organisch materiaal, stofkringlopen, de afbraak van milieuvreemde verbindingen, en ze vormen het voedsel voor hogere trofische niveaus. Aantasting van de microbiële gemeenschap in bodem en oppervlaktewater als gevolg van milieu­verontreiniging heeft rechtstreekse gevolgen voor het functioneren van het ecosysteem. Technieken voor de bestudering van de diversiteit van bacteriën werden geoptimaliseerd voor de detectie van effecten van heterogene metaal­verontreiniging in het veld, en toegepast op de drie SSEO-locaties.

Om de effecten van metalen op bacteriën in ecosystemen te bestuderen zijn drie technieken gebruikt. Profielen van de bacteriegemeenschap werden gemaakt met Community-Level Physiological Profiling (CLPP) en Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Deze technieken hebben als overeenkomst dat in één experiment meerdere eigenschappen van één gemeenschap worden bepaald, zogenaamde multi-eindpunt technieken. De derde techniek, Pollution-Induced Community Tolerance (PICT), is gebruikt om de gevoeligheid van de gemeenschap voor verschillende metalen te bepalen. Door deze verschillende technieken te combineren is het mogelijk om de correlatieve verbanden tussen de aanwezigheid van metalen in het veld en de waargenomen effecten te versterken.

Ondanks de voordelen van PICT om sterke verbanden te vinden, is niet onomstotelijk aangetoond dat PICT een bruikbare indicator is voor negatieve effecten van verontreiniging op het ecosysteem. Uit een literatuurstudie gericht op bodemonderzoek bleek dat in de meeste gevallen waarbij PICT werd aangetroffen het aannemelijk is dat ook andere veranderingen in het ecosysteem optraden, zoals verschuivingen in de structuur en het functioneren, inclusief veranderende relaties naar andere organismen en processen. Er zijn slechts weinig publicaties waarin deze relaties expliciet gelegd zijn en de conclusie was dat meer onderzoek nodig is voordat PICT opgenomen kan worden in een raamwerk voor ecologische risicobeoordeling.

De onderliggende modelconcepten voor het aquatische en terrestrische onderzoek op de drie SSEO-locaties waren steeds hetzelfde. De hypothese is dat effecten van metaal­verontreiniging nauwkeurig in beeld gebracht kunnen worden via het aantonen van subtiele veranderingen in de fysiologische eigenschappen en de samenstelling van bacterie­gemeen­schappen en veranderingen in de gevoeligheid van de gemeenschap voor de betreffende contaminant. Bacteriën leven in innig contact met hun omgeving, en dus ook met de verontreiniging, zodat effectieve blootstelling aangenomen kan worden. Bacteriën hebben een zeer beperkte mobiliteit zodat de relatie tussen de gemeten metaalconcentraties en de samen­stelling van de bacteriegemeenschap in één monster stevig is. Dit aspect is vooral van belang in sterk heterogene situaties, zoals bij de drie SSEO-locaties het geval was. Tenslotte hebben bacteriën vanwege hun geringe afmeting een grote oppervlakte inhoud ratio zodat de kenmerken van de omgeving, inclusief verontreiniging, in zijn algemeenheid sterker tot expressie komen in de fysiologie van de bacteriën en de samenstelling van de gemeenschap dan bij grotere bodem­organismen. Analyse van bacteriegemeenschappen met behulp van multi-eindpunt technieken en multi-variate analyse wordt daarom geacht een gevoelig instrument te vormen voor het aantonen van effecten van verontreiniging in het veld.

Voor de bestudering van bacteriegemeenschappen bij de drie SSEO-locaties zijn technieken ontwikkeld, geoptimaliseerd en uitgetest voor de verschillende milieucompartimenten. Bij het onderzoek aan bodemecosystemen in De Ronde Venen is de techniek voor het nemen en selecteren van monsters verbeterd en vereenvoudigd zodat een optimale gradiënt met metaal­concentraties verkregen werd die representatief is voor de locatie. Bovendien werd een methode ontwikkeld om monsters in te vriezen en langdurig bij -70° te bewaren, zonder significante aantasting van de onderliggende structuur in de bacteriegemeenschap. Voor het onderzoek aan aquatische ecosystemen in de Afferdensche en Deestsche waarden en de Biesbosch werd een methode ontwikkeld om de bacteriën uit sedimentmonsters te extraheren en te analyseren voor CLPP en PICT. Tevens werden aquatische organismen via hechting aan glasplaten bemonsterd, om deze te gebruiken voor additionele blootstelling in het laboratorium onder gecontroleerde omstandigheden in aquaria.

Heterotrofe bacteriegemeenschappen in fotosynthetiserende biofilms op glasplaten werden gedurende 26 dagen blootgesteld aan koper in aquaria in het laboratorium. Onder invloed van koper veranderden de CLPP- en de DGGE-patronen en werd PICT aangetoond. Er werden geen effecten van de temperatuur gevonden op de bacteriegemeenschappen. Dit betekent dat de temperatuur niet de belangrijkste factor was in het veroorzaken van veranderingen onder deze laboratorium condities. Er werd wel een effect van de temperatuur gevonden op de tolerantie­ontwikkeling.  Het herstel van de biofilms na koperblootstelling werd ook bestudeerd gedurende ## dagen. De veranderingen aan de bacteriegemeenschappen bleken omkeerbaar voor wat betreft de CLPP, maar slechts gedeeltelijk omkeerbaar voor de DGGE-patronen gedurende de herstelfase. Ook de gevoeligheid van de gemeenschap voor koper keerde weer gedeeltelijk terug. De conclusie was dat de fysiologische eigenschappen van bacterie­gemeenschappen sneller herstellen dan de genetische samenstelling.

Het mogelijke effect van metalen op bacteriegemeenschappen in biofilms van rivier­sedimenten werd onderzocht op twee SSEO-locaties, namelijk de Afferdensche en Deestsche waarden (Figuur 3) en de Sliedrechtse Biesbosch (Figuur 4). Het onderzoek liet zien dat genetische en fysiologische diversiteit van bacteriegemeenschappen gecorreleerd is met de aanwezigheid van bepaalde algensoorten en nauwelijks met het niveau van metaalverontreiniging. Daarom werd geconcludeerd dat de correlaties tussen de genetische en fysiologische diversiteit van bacteriegemeenschappen en micro-algensoorten geïnterpreteerd moet worden als een indicatie voor een sterke en soortspecifieke verbintenis tussen algen- en bacteriesoorten in sedimenten van de uiterwaarden. Eventuele effecten van metalen werden bij dit onderzoek gemaskeerd door de effecten van de seizoenen en andere verschillen in de omgevingsvariabelen.

Effecten van zware metalen op bacteriegemeenschappen in de bodem van graslanden in de gemeente De Ronde Venen (zogenaamde Toemaakdek; Figuur 2) werden onderzocht. Verbanden werden waargenomen tussen CLPP en DGGE en de metaalconcentraties in het veld, de pH in de bodem en de hoeveelheid organisch materiaal. De effecten van alle bekende omgevingsvariabelen werden statistisch van elkaar gescheiden, waardoor aannemelijk werd dat metalen inderdaad een effect hebben op de fysiologische en genetische samenstelling van de bacteriegemeenschappen in de grasland van De Ronde Venen, los van de andere omgevings­variabelen. SSEO-onderzoek van de Wageningen Universiteit (A. van der Wurff) in dezelfde bodemmonsters maakte duidelijk dat ook bij de nematodengemeenschap effecten van metalen aannemelijk zijn. PICT bij bacteriële gemeenschappen werd niet gevonden. Dit negatieve resultaat kan waarschijnlijk toegekend worden aan het overheersende optreden van indirecte effecten of een methodische tekortkoming.

De resultaten werden geëvalueerd en geplaatst in een kader voor de ontwikkeling van een raamwerk voor ecologische risicobeoordeling. Metaaleffecten op de bacterie­gemeenschappen kwamen voor bij monsters waarin lood en koper de Interventiewaarden over­schreden. Geconcludeerd werd dat er geen aanleiding is om de Interventiewaarden te versoepelen, ook niet in het geval van het Toemaakdek in De Ronde Venen. De veranderingen in de microbiële diversiteit onder invloed van hoge metaalbelasting konden worden uitgedrukt in simpele maten die geschikt zijn voor een ecologische risicobeoordeling. De technieken CLPP, DGGE en PICT worden aanbevolen voor een “higher tier testing” bij ecologische risicobeoordeling.

014.23.062 Dr. S.A.E. Kools

Het poldergebied in de gemeente de Ronde Venen is op veel plaatsen verontreinigd met zware metalen doordat men vroeger de veengrond ophoogde met stadsafval. De nu aanwezige bodem onder de graslanden is feitelijk volledig door de mens gemaakt en niet natuurlijk. Het wordt "toemaakdek" genoemd. Op verschillende plaatsen worden behoorlijk hoge concentraties van metalen aangevonden. De concentratie van lood overschrijdt veelvuldig de interventiewaarde, dat wil zeggen dat er een noodzaak is tot sanering. Het hier uitgevoerde onderzoek stelde zich ten doel om vast te stellen welke effecten de aanwezige verontreiniging had op het ecologisch functioneren van de bodem.

Ecologische functies worden meestal onderscheiden van ecologische structuur. Met het laatste wordt de aanwezigheid van soorten bedoeld, inclusief hun biomassa, interacties en voedselrelaties. Over het algemeen wordt aangenomen dat beschadiging van de ecologische structuur, bijv. door afname van soortendiversiteit, negatieve gevolgen heeft voor het ecologisch functioneren van een bodem omdat een zekere mate van soortenrijkdom nodig is voor een goed verloop van bodemprocessen zoals afbraak van organisch materiaal, nutriëntenmineralisatie en bodemvorming. Het is echter niet zo dat alle soorten een gelijke of evenredige invloed hebben op de bodemprocessen. Over het algemeen wordt verondersteld dat het verlies van enkele soorten nog niet merkbaar is in het functioneren. Deze veronderstelling, die in de internationale ecologische literatuur veel aandacht krijgt, vormde de achtergrond van het onderzoek.

De aanpak van het onderzoek maakte gebruik van zogenaamde terrestrische modelecosystemen (TMEs). Deze bestonden uit bodemkolommen waarvan er in het veld zo'n 80 voor één experiment gestoken werden; deze kolommen werden in het laboratorium bij constante luchtvochtigheid, temperatuur en licht opgesteld en er werd op veel verschillende manieren aan gemeten. Onder andere werd in het laboratorium van de Vrije Universiteit in het Instituut voor Ecologische Wetenschappen, gekeken naar de bodemademhaling, de mineralisatie van stikstof, de afbraak van een toegevoegd herbicide en de biomassa van een groot aantal bodembewonende organismen. Ook werd bekeken of een bodem door de aanwezige vervuiling kwetsbaarder was voor nieu aangebrachte stressfactoren ("stress-op-stress").

De TME-benadering heeft als voordeel dat de laboratoriummetingen gestandaardiseerd en reproduceerbaar zijn, terwijl er toch gekeken wordt naar een situatie die erg lijkt op die in het veld. Het onderzoek had daarom een typisch "systeemgericht" karakter, wat ook de bedoeling was in het programma "systeemgerichte ecotoxicologie" van NWO, waarin het project viel. De kolommen werden gestoken op plaatsen die van te voren in kaart gebracht waren, zodat de verschillen tussen de TME-kolommen in de hand te houden waren. Door deze voor-screening konden effecten gemakkelijker vastgesteld worden, omdat een brede reeks aan vervuiling in de kolommen aanwezig was. Naast het TME-onderzoek werden veldwaarnemingen verricht die aansloten bij het landelijk meetnet bodemkwaliteit, dat door het RIVM gecoördineerd wordt.

Uit het onderzoek blijkt dat de biomassa van sommige groepen bodemdieren negatief beïnvloed wordt door de vervuiling, waarschijnlijk vooral door het element lood. De dieren die het meest te leiden hadden waren de potwormen, een groep van kleine, witte wormen, behorend tot de familie Enchytraeidae (een zusterfamilie van de meer bekende Lumbricidae, de regenwormen). Over potwormen is nog weinig bekend; desondanks zijn ze speciaal in verzuurde graslanden zeer dominant aanwezig en numeriek belangrijker dan regenwormen. Naast de effecten op potwormen werden ook effecten gevonden op verschillende activiteitsmetingen, zoals de meting waarbij een staafje met gaatjes gevuld met een organische pasta in de bodem gebracht wordt en gekeken wordt naar het openvallen van de gaatjes, wat een maat is voor de afbraak van het organisch materiaal ("bait lamina"). Deze uiterst simpele methode bleek heel goed bruikbaar en in verschillende experimenten te reageren op vervuiling. Ook in de mineralisatie van stikstof werden effecten gevonden. Naast deze min of meer duidelijk effecten werden ook bij een groot aantal metingen geen effecten gevonden.

De conclusie van het onderzoek is dat het ecologisch functioneren van de toemaakdek in de Ronde Venen op verschillende punten verstoord is. Die verstoringen worden aangetroffen in situaties waarbij de interventiewaarde wordt overschreden. Bij lagere concentraties worden echter geen effecten gevonden. Hiermee is wordt dus bevestigd dat met de interventiewaarden een goede scheiding aangebracht kan worden tussen situaties die niet en die wel ecologisch verontrustend zijn. Door de enorme ruimtelijke variatie ontstaat in de praktijk een mozaïek van pleksgewijze vervuiling en lokale effecten, die niet gelijkelijk over een kavel verdeeld zijn, maar zich als een vlekkenpatroon uitstrekken.

Ook opvallend is dat de in het bodembeleid gehanteerde formules om concentraties van stoffen om te rekenen naar een "standaardbodem" voor de toemaakdek niet lijken op te gaan. In plaats dat met deze formules op een goede manier gecorrigeerd wordt voor het kleigehalte en het gehalte organische stof, wordt juist een tegencorrectie aangebracht. Normaal gesproken is er een positief verband tussen het kleigehalte en de concentratie aan metalen, maar dit verband is in de toemaakdek vaak negatief. Daarom wordt op basis van het onderzoek aanbevolen het continusysteem voor bodemtypecorrectie niet toe te passen op de toemaakdek.

Uit het onderzoek volgen ook belangrijke implicaties voor de ecologische theorie. Zoals boven vermeld, wordt meestal aangenomen dat er in een ecosysteem een onderscheid aangebracht kan worden tussen de structuur van het systeem en zijn functioneren. Gaat men in de praktijk meten dan blijkt dat onderscheid niet altijd duidelijk te zijn. Zeker is het niet zo dat metingen gedaan op een hoger hiërarchisch niveau (levensgemeenschap, ecosysteem) altijd ongevoeliger reageren dan metingen op een lager niveau (populatie, individu). Uit het onderzoek blijkt dat gekeken moet worden naar het aantal verschillende onderliggende processen dat door een bepaald hiërarchisch niveau geïntegreerd wordt. Het onderzoek laat zien dat de gangbare theorie over de indeling van niveaus in de ecologie opnieuw bekeken moet worden.

014.23.063 Dr. A.W.G. van der Wurff

Het gebied de Ronde Venen, polder Demmerik (52°13’ Noord 4°56’ Oost) is een grasland ecosysteem dat gedomineerd wordt door m.n. engels raaigras (Lolium perenne) en smalbladig weegbree (Plantago lanceolata). Het van oorspronkelijk veengebied werd afgegraven vanaf de veertiende eeuw. Grote hoeveelheid duinzand en vuil uit de grote steden gebruikt om de bodem op te vullen en te verstevigen om het vervolgens in het gebruik te nemen voor landbouw. Dit heeft geresulteerd in een mozaïek van vervuilde plekken met een mix van o.a. zware metalen en poly- aromatische koolwaterstoffen (PAK). Vooral de zware metaal concentraties overschrijden de waarden zoals vastgelegd in de Nederlandse Bodembeschermingwet.

  Onze resultaten laten zien dat de nematoden gemeenschap, ondanks de ongelijkmatige verdeling van de vervuiling, grosso modo in de Ronde Venen getekend is door de vervuiling (gemiddelde Maturity Index = 2.18). Opvallend is dat er in het veld twee duidelijke gradiënten (hiermee wordt Principal Component gradiënten bedoeld en geen fysieke gradiënten in het veld) zijn gevonden die gerelateerd zijn aan een verandering in nematode gemeenschappen, namelijk totale zink concentratie en organische fractie. Beide gradiënten zijn negatief gecorreleerd.

  De locale verschillen in zink concentraties zijn gecorreleerd met subtiele verschillen in locale gemeenschappen, zoals verschillen in aantallen van gevoelige soorten (gevoeligheid  van cp2 tot 5, waar 5 is meest gevoelig) zoals de plant parasieten Trichodorus (cp4) en Tylenchorhynchus (cp3),  de bacterie-eter Alaimus (cp4) , de carnivoor Mononchus (cp4) en de omnivoor Oxidirus (cp5).

  De locale verschillen in de organische fractie hebben invloed op een bepaalde groep bacterie-etende nematoden die gekenmerkt worden door een snelle turn -over en relatief ongevoelig zijn voor vervuiling (zgn. verrijkingsopportunisten van de nematode families Rhabditidae en Dilpogastridae). De aantallen van deze nematoden hangt samen met de aantallen van bacteriën (gemeten op basis van colony forming units CFU).

  Om te kijken of zink verantwoordelijk is voor de verstoorde nematode gemeenschap is er een experiment uitgevoerd waarbij extra zink werd toegevoegd aan de bodem. De gedachte hierachter is dat als de nematoden gemeenschap lange tijd onder invloed heeft gestaan van zink, er weinig verandert als er extra zink wordt toegevoegd. Dit idee staat bekend onder de naam PICT (Pollution Induced Community Tolerance). Er zijn grond kolommen gestoken en meegenomen naar het laboratorium (zgn. Terrestrial Model Ecosystems, d.i. TME). Onder gecontroleerde omstandigheden zijn er eenmalig hoge concentraties (1600 mg/Kg) zink toegevoegd aan een deel van de kolommen om de reactie (gedurende 16 weken) te vergelijken met onbehandelde referenties. Daarnaast zijn er ook kolommen blootgesteld aan hitte (40oC in 24 uur). Dit is gedaan om te kijken of nematode gemeenschappen die lange tijd hebben blootgestaan aan zink extra gevoelig zijn met betrekking tot andere verstoringen zoals verhoogde temperatuur bij een klimaatsverandering.

  Uit de analyse blijkt dat de nematode gemeenschappen van zowel de relatief laag vervuilde plekken als wel de hoog vervuilde plekken weinig reageren als er extra zink wordt toegediend. Dit geeft aan dat een duidelijk PICT effect niet kon worden aangetoond. Deze uitkomst komt overeen met bacteriestudies van Boivin et al. (Appl. Soil Ecol, accepted). Vermoedelijk is de verdeling in hoge en lage verontreiniging niet homogeen genoeg. De diversiteit in reactie van de nematode gemeenschap compositie was echter hoger in de laag vervuilde bodem.

  De hitte schok veroorzaakte echter wel een significant andere reactie tussen de nematode gemeenschappen van laag en hoog vervuilde plekken. De structuur en de diversiteit in soorten namen sterk af toen de gemeenschappen van hoog vervuilde locatie werd blootgesteld aan hitte. Opvallend is dat ook de relatief ongevoelige soorten zoals de verrijkingsopportunisten (Rhabditidae) sterk afnemen in abundantie. De relatief ongevoelige plant parasitaire nematode Paratylenchus (cp2) floreert onder zowel zink als wel hitte stress en neemt in hoge mate in aantal toe.