Changing consortia of algae and bacteria in polluted rivers and lakes: discriminating the roles of toxicants and natural variables

Diversiteit van microbiële gemeenschappen bij heterogene metaalverontreinigde milieus

Wanneer de overheidsnormen voor metaalvervuiling in de bodem worden overschreden, treden veranderingen op in de microbiële gemeenschap in die bodem. Dat hebben Marie-Elène Boivin en Gerdit Greve aangetoond in hun studie naar de invloed van zware metalen op bacteriële gemeenschappen. Die veranderingen kunnen het bodem­ecosysteem aantasten. Bacteriën zijn overal en onmisbaar voor een gezond ecosysteem, ze spelen een sleutelrol in bijvoorbeeld de omzetting van organisch materiaal, zodat voedingsstoffen weer bruikbaar worden voor andere organismen. Hun diversiteit is indrukwekkend. Een gram grond telt ongeveer 10⁴-10⁵ verschillende soorten bacteriën. Een hectare akkergrond bevat 3000 kg bacteriën in de bovenste 25 cm, dat is gelijk aan de biomassa van ongeveer vier koeien of zestig schapen. Door de extreme diversiteit is de studie van bacteriële gemeenschappen niet eenvoudig en is de combinatie van technieken de meeste geschikte aanpak om bacteriële gemeenschappen te analyseren. Boivin en Greve pasten in hun onderzoek fysiologische en genetische methoden toe. De onderzoekers bestudeerden bacteriële gemeenschappen van akkergrond van Vinkeveen en van sediment van de Afferdensche en Deestsche waarden en van de Sliedrechtse Biesbosch. Deze drie locaties zijn vervuild met zware metalen, en dat kan een negatieve invloed op het ecosysteem hebben. Boivin en Greve vergeleken de effecten op bacteriegemeenschappen daar met de classificatie van grond en sedimenten gebaseerd op de Nederlandse Streef- en Interventiewaarden. Metaaleffecten bij de bacteriegemeenschappen kwamen alleen voor op die plaatsen waar de Interventiewaarden voor lood en koper werden overschreden.

Management samenvatting

Effecten van metalen in bodemecosystemen van graslanden in de Gemeente De Ronde Venen werden aangetoond op het niveau van de interventiewaarde voor lood en koper. Effecten van metalen op bacteriegemeenschappen in biofilms van sedimenten in de Afferdensche en Deestsche waarden en de Sliedrechtse Biesbosch konden niet worden aangetoond, waarschijnlijk als gevolg van een te sterke dynamiek in deze systemen en een relatief lage belasting. Voor het onderzoek werden drie verschillende technieken ingezet om subtiele veranderingen in de samenstelling van bacteriegemeenschappen aan te tonen, namelijk op het niveau van de fysiologische en genetische eigenschappen, en op het niveau van de gevoeligheid van de gemeenschap voor het verontreinigende metaal. Optimalisatie en validatie van de methoden voor bemonstering, extractie en opslag van bacteriën in het laboratorium, en voor de verschillende analyses vormde een integraal onderdeel van het onderzoek. Geconcludeerd werd dat deze methoden zeer gevoelig en ecologisch relevant zijn, en uitermate geschikt voor ‘higher tier testing’ in een locatie-specifieke ecologische risicobeoordeling.

Uitgebreide samenvatting van het onderzoek

Het effect van metalen op de diversiteit van microbiële gemeenschappen op de drie metaal­verontreinigde onderzoekslocaties van SSEO werd onderzocht. Micro-organismen zijn onmisbaar voor een gezond (bodem)ecosysteem. Ze spelen een sleutelrol in belangrijke processen zoals de omzetting van organisch materiaal, stofkringlopen, de afbraak van milieuvreemde verbindingen, en ze vormen het voedsel voor hogere trofische niveaus. Aantasting van de microbiële gemeenschap in bodem en oppervlaktewater als gevolg van milieu­verontreiniging heeft rechtstreekse gevolgen voor het functioneren van het ecosysteem. Technieken voor de bestudering van de diversiteit van bacteriën werden geoptimaliseerd voor de detectie van effecten van heterogene metaal­verontreiniging in het veld, en toegepast op de drie SSEO-locaties.

Om de effecten van metalen op bacteriën in ecosystemen te bestuderen zijn drie technieken gebruikt. Profielen van de bacteriegemeenschap werden gemaakt met Community-Level Physiological Profiling (CLPP) en Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Deze technieken hebben als overeenkomst dat in één experiment meerdere eigenschappen van één gemeenschap worden bepaald, zogenaamde multi-eindpunt technieken. De derde techniek, Pollution-Induced Community Tolerance (PICT), is gebruikt om de gevoeligheid van de gemeenschap voor verschillende metalen te bepalen. Door deze verschillende technieken te combineren is het mogelijk om de correlatieve verbanden tussen de aanwezigheid van metalen in het veld en de waargenomen effecten te versterken.

Ondanks de voordelen van PICT om sterke verbanden te vinden, is niet onomstotelijk aangetoond dat PICT een bruikbare indicator is voor negatieve effecten van verontreiniging op het ecosysteem. Uit een literatuurstudie gericht op bodemonderzoek bleek dat in de meeste gevallen waarbij PICT werd aangetroffen het aannemelijk is dat ook andere veranderingen in het ecosysteem optraden, zoals verschuivingen in de structuur en het functioneren, inclusief veranderende relaties naar andere organismen en processen. Er zijn slechts weinig publicaties waarin deze relaties expliciet gelegd zijn en de conclusie was dat meer onderzoek nodig is voordat PICT opgenomen kan worden in een raamwerk voor ecologische risicobeoordeling.

De onderliggende modelconcepten voor het aquatische en terrestrische onderzoek op de drie SSEO-locaties waren steeds hetzelfde. De hypothese is dat effecten van metaal­verontreiniging nauwkeurig in beeld gebracht kunnen worden via het aantonen van subtiele veranderingen in de fysiologische eigenschappen en de samenstelling van bacterie­gemeen­schappen en veranderingen in de gevoeligheid van de gemeenschap voor de betreffende contaminant. Bacteriën leven in innig contact met hun omgeving, en dus ook met de verontreiniging, zodat effectieve blootstelling aangenomen kan worden. Bacteriën hebben een zeer beperkte mobiliteit zodat de relatie tussen de gemeten metaalconcentraties en de samen­stelling van de bacteriegemeenschap in één monster stevig is. Dit aspect is vooral van belang in sterk heterogene situaties, zoals bij de drie SSEO-locaties het geval was. Tenslotte hebben bacteriën vanwege hun geringe afmeting een grote oppervlakte inhoud ratio zodat de kenmerken van de omgeving, inclusief verontreiniging, in zijn algemeenheid sterker tot expressie komen in de fysiologie van de bacteriën en de samenstelling van de gemeenschap dan bij grotere bodem­organismen. Analyse van bacteriegemeenschappen met behulp van multi-eindpunt technieken en multi-variate analyse wordt daarom geacht een gevoelig instrument te vormen voor het aantonen van effecten van verontreiniging in het veld.

Voor de bestudering van bacteriegemeenschappen bij de drie SSEO-locaties zijn technieken ontwikkeld, geoptimaliseerd en uitgetest voor de verschillende milieucompartimenten. Bij het onderzoek aan bodemecosystemen in De Ronde Venen is de techniek voor het nemen en selecteren van monsters verbeterd en vereenvoudigd zodat een optimale gradiënt met metaal­concentraties verkregen werd die representatief is voor de locatie. Bovendien werd een methode ontwikkeld om monsters in te vriezen en langdurig bij -70° te bewaren, zonder significante aantasting van de onderliggende structuur in de bacteriegemeenschap. Voor het onderzoek aan aquatische ecosystemen in de Afferdensche en Deestsche waarden en de Biesbosch werd een methode ontwikkeld om de bacteriën uit sedimentmonsters te extraheren en te analyseren voor CLPP en PICT. Tevens werden aquatische organismen via hechting aan glasplaten bemonsterd, om deze te gebruiken voor additionele blootstelling in het laboratorium onder gecontroleerde omstandigheden in aquaria.

Heterotrofe bacteriegemeenschappen in fotosynthetiserende biofilms op glasplaten werden gedurende 26 dagen blootgesteld aan koper in aquaria in het laboratorium. Onder invloed van koper veranderden de CLPP- en de DGGE-patronen en werd PICT aangetoond. Er werden geen effecten van de temperatuur gevonden op de bacteriegemeenschappen. Dit betekent dat de temperatuur niet de belangrijkste factor was in het veroorzaken van veranderingen onder deze laboratorium condities. Er werd wel een effect van de temperatuur gevonden op de tolerantie­ontwikkeling.  Het herstel van de biofilms na koperblootstelling werd ook bestudeerd gedurende ## dagen. De veranderingen aan de bacteriegemeenschappen bleken omkeerbaar voor wat betreft de CLPP, maar slechts gedeeltelijk omkeerbaar voor de DGGE-patronen gedurende de herstelfase. Ook de gevoeligheid van de gemeenschap voor koper keerde weer gedeeltelijk terug. De conclusie was dat de fysiologische eigenschappen van bacterie­gemeenschappen sneller herstellen dan de genetische samenstelling.

Het mogelijke effect van metalen op bacteriegemeenschappen in biofilms van rivier­sedimenten werd onderzocht op twee SSEO-locaties, namelijk de Afferdensche en Deestsche waarden (Figuur 3) en de Sliedrechtse Biesbosch (Figuur 4). Het onderzoek liet zien dat genetische en fysiologische diversiteit van bacteriegemeenschappen gecorreleerd is met de aanwezigheid van bepaalde algensoorten en nauwelijks met het niveau van metaalverontreiniging. Daarom werd geconcludeerd dat de correlaties tussen de genetische en fysiologische diversiteit van bacteriegemeenschappen en micro-algensoorten geïnterpreteerd moet worden als een indicatie voor een sterke en soortspecifieke verbintenis tussen algen- en bacteriesoorten in sedimenten van de uiterwaarden. Eventuele effecten van metalen werden bij dit onderzoek gemaskeerd door de effecten van de seizoenen en andere verschillen in de omgevingsvariabelen.

Effecten van zware metalen op bacteriegemeenschappen in de bodem van graslanden in de gemeente De Ronde Venen (zogenaamde Toemaakdek; Figuur 2) werden onderzocht. Verbanden werden waargenomen tussen CLPP en DGGE en de metaalconcentraties in het veld, de pH in de bodem en de hoeveelheid organisch materiaal. De effecten van alle bekende omgevingsvariabelen werden statistisch van elkaar gescheiden, waardoor aannemelijk werd dat metalen inderdaad een effect hebben op de fysiologische en genetische samenstelling van de bacteriegemeenschappen in de grasland van De Ronde Venen, los van de andere omgevings­variabelen. SSEO-onderzoek van de Wageningen Universiteit (A. van der Wurff) in dezelfde bodemmonsters maakte duidelijk dat ook bij de nematodengemeenschap effecten van metalen aannemelijk zijn. PICT bij bacteriële gemeenschappen werd niet gevonden. Dit negatieve resultaat kan waarschijnlijk toegekend worden aan het overheersende optreden van indirecte effecten of een methodische tekortkoming.

De resultaten werden geëvalueerd en geplaatst in een kader voor de ontwikkeling van een raamwerk voor ecologische risicobeoordeling. Metaaleffecten op de bacterie­gemeenschappen kwamen voor bij monsters waarin lood en koper de Interventiewaarden over­schreden. Geconcludeerd werd dat er geen aanleiding is om de Interventiewaarden te versoepelen, ook niet in het geval van het Toemaakdek in De Ronde Venen. De veranderingen in de microbiële diversiteit onder invloed van hoge metaalbelasting konden worden uitgedrukt in simpele maten die geschikt zijn voor een ecologische risicobeoordeling. De technieken CLPP, DGGE en PICT worden aanbevolen voor een “higher tier testing” bij ecologische risicobeoordeling.